故事发生在2004年，即《生化危机2》六年后，由于各新闻媒体争相报道安布雷拉公司在浣熊市的地下研究所，制作的T病毒早前泄漏导致陷入生化的危机。连串的负面新闻导致公司股票价格一直暴跌。美国联邦政府在各国政府的压力下暂停安布雷拉公司的业务，其后公司便宣告破产，所有地下研究中断，T病毒的传播得以停止。
里昂
当年新任警察的里昂，现在为美国总统直辖的最高机密组织成员。这次被派遣到欧洲某个（实际上是西班牙）村庄，受命拯救总统被拐去的女儿阿什莉·格拉汉姆（Ashley Graham）。在拯救的途中他发现阿什莉的绑架者是一个宗教团体，名叫“光明教团”（Los Illuminados，西班牙语：照亮的道路），教主是奥斯穆德·萨德勒（Osmund Saddler）。
里昂在村庄的房间救出了一个男子路易斯·赛拉（Luis Sera），从他口中得知阿什莉正被关在村内的教堂二楼，就是这个时候村长毕拖雷斯·门德斯（Bitores Mendes）出现，里昂跟村长交手可谓不堪一击，里昂及路易斯都被击晕了。
同时，萨德勒出现，并且在里昂身上注射了寄生体“Las Plagas”。Las Plagas为一种寄生生物，可导致宿主变异，并被特殊的超声波／次声波控制。第一代需要注射卵，而第二代可直接从消化道植入成虫。
里昂醒过来的时候在山谷的另一边，他跟路易斯避开村民的袭击后，路易斯便独自逃去。里昂回到村庄的教堂救出了阿什莉，并且利用强大武器击倒了村长，于是离开村庄，一心等待美国联邦政府派来的直升机，但是大量村民赶到，于是里昂带着阿什莉逃进了一座城堡。
到了教会城堡，但在里面等着他们的似乎是更凶猛的教徒……
躲过教徒们们猛烈的炮火，喘歇之际，路易斯又来了，并告诉里昂他拿到了病毒的样本，然后问阿什莉是不是也被种下了种子， 阿什莉又回想起了一幕幕恐怖的画面，无奈的点了点头，正兴高采烈之际，路易斯发现样本丢了，于是决定再返回去找，里昂拦他，但他却执意要去，里昂问他为什么为别人拼命，路易斯表示了事情成这样和自己有很大关系
里昂跟阿什莉遇上了堡主雷蒙·萨拉哲（Ramon Salazar），堡主在地下矿场利用村民发掘寄生体Las Plagas并且供给光明教团。
两人突破重重包围，共同解决不少迷题后，走到城邦中央时，阿什莉突然觉得身体不适，里昂问他有没有问题，谁知她叫里昂不要碰她，说着就拼命跑，终于掉入了陷阱，被一个机关弄到了墙的后面，里昂束手无策只好再去找线索来救阿什莉……在一个大庭院里，收到了雷蒙的信号，他把外界的信号给切断了，也就是说现在等不到支援了，那就只能一切靠自己，雷蒙告诉里昂这是一座迷宫，有时候自己都出不去在迷宫里受尽疯狗的撕咬后终于拿到了可以到达阿什莉机关房间的纹章，刚要离开花园，突然遭到某个似乎是熟人的袭击，一番较量之后发现来人是艾达，艾达摘下了墨镜：里昂,好久不见！
里昂重遇了艾达·王，他在《生化危机2》后已经得知艾达是威斯克（Albert Wesker）派来的间谍，所以他对艾达的再次出现充满怀疑，突然艾达掉落在地的墨镜发出一阵白烟，艾达消失了……里昂始终很关心这个埋藏在心中的女子。
里昂之后来到了机关房间的二楼，路易斯也来了，高兴的告诉里昂找到样本了，突然被一支巨大的蝎子尾巴刺穿了，原来是教主萨德勒，样本被取走了， 里昂发誓要为路易斯报仇，用狙击枪，打掉阿什莉身上的枷锁，再干掉扑向他的敌人，终于和里昂会合了，就要逃出城堡之际，阿什莉再次落入雷蒙的陷阱，而里昂也掉入了城堡的地道里，而雷蒙也派出了自己的左右手之一去杀里昂,逃过了追杀，又回到了地面，要面对无穷的飞行变异体。
终于和雷蒙开始了决斗，雷蒙和巨大的触手融合，变成了狰狞异常的庞然大物，一阵周旋之后雷蒙终于被里昂击杀。
阿什莉被雷蒙抓走后送到遥远的有军事设施的孤岛后，在里昂击倒了雷蒙后再次遇上艾达，艾达询问英俊的里昂需不需要送他一程，里昂只能以尴尬的表情回答。
里昂在孤岛上重遇据报在两年前直升机失事死亡的战友杰克·克劳萨（Jack Krauser）。原本他是安布雷拉公司的威斯克派来到这里做卧底。也是更为强悍的敌人：狂暴化的佣兵。这时的敌人，攻击力和移动都有了相当程度的提升…..
就快到最终决战了，这时里昂感到身体不适，艾达出现，问里昂怎样？里昂红着双眼，突然卡住艾达的脖子。艾达毕竟是训练有素的特工，拿出匕首猛扎在里昂腿上，里昂似乎也清醒了…….
终于见到了巫师，和被关在容器里的阿什莉,当里昂正要和巫师决一死战时，艾达又出现了，拿枪冲巫师一通扫射，并让里昂赶快救 阿什莉，趁着巫师被艾达牵制时里昂救下了阿什莉，两人从后门逃出去了，这边，只见巫师血管涌动，刚才中的子弹全被他挤了出来朝后门追去，艾达打爆了门口的油桶，将巫师点燃……
里昂和阿什莉在实验室分别帮对方将身体内的种子去掉，两人拼命的跑，在一个升降机前，里昂让阿什莉停下，自己上去看看情况。里昂上到一片工地，赫然发现艾达被吊在半空中，刚想去救他，巫师安然无恙的出现了，并最终兽化，变成了大蝎子……
里昂最终又用艾达抛来的火箭筒终结了最终敌人,艾达也又用枪指向了里昂（6年前经典场面重现）要里昂交出病毒样本……..
最终里昂成功抢救了阿什莉并且逃脱。但是，艾达也成功夺取了Las Plagas样品，可能使安布雷拉公司死灰复燃。
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